Print
De Western blot maakt deel uit van het zgn. 2-testprotocol zoals voorgesteld is door de CDC (Center for Disease Control). Hierbij is de ELISA een screeningtest (zoektest) en wordt ingeval van een positieve of twijfelachtige ELISA aanbevolen om de WB uit te voeren als conformatietest (bevestigingstest). In de Dearborn meeting in 1994 bereikten functionarissen van overheidsinstellingen als CDC en ASTPHLD consensus over de criteria voor de interpretatie van de WB. Deze criteria zijn gebaseerd op de studies van Dressler et al. en van Engstrom et al. Om aan de voorwaarde van een positieve WB te voldoen, gaat men uit van het gebruik van de B. burgorferi stam (B31, 297 en 2591) en is het noodzakelijk dat voor een positieve IgM tenminste twee banden positief zijn van de volgende drie, p23, p39 en p41kDa, waarbij de p23 band het OspC vertegenwoordigt. Voor een positieve IgG moeten er tenminste vijf banden positief zijn van de volgende tien banden, tw. 18-, 23-, 28,- 30,- 39,- 41,- 45,- 58,- 66,- en 93kDa.

De CDC vermeldt uitdrukkelijk dat deze criteria bedoeld zijn voor de diagnose van Lyme voor "public health surveillance" rapportage doeleinden. Echter, deze criteria zijn overgenomen door medici als basis voor de diagnose voor Lyme in de dagelijkse praktijk, waarvoor ze nooit bedoeld waren.

De ILADS heeft duidelijke kritiek op deze door de CDC gehanteerde criteria en heeft hierover een "position paper" gepubliceerd. Veel wetenschappers zijn het eveneens niet eens met deze criteria en vinden dat deze willekeurig gekozen zijn omdat;
Ten eerste berust de studie van Dressler et al. slechts op patiënten die een EM en geen artritis noch neuroborreliose hadden en die slechts voor een periode van 4 maanden werden gevolgd en bij Engstrom waren alleen vroege Lymepatiënten geselecteerd.
Ten tweede gebruikte Dressler de stam B. burgdorferi sensu stricto G39/40 en niet de door de CDC voorgeschreven stammen B. burgdorferi s.s. B31, 297, 2591, hoewel Engstrom de B. burgdorferi sensu stricto 297 gebruikte voor zijn IgM criteria.
Ten derde werden de hoogspecifieke banden p31 OspA en p34 OspB niet opgenomen in de criteria, omdat volgens Dressler ze niet belangrijk zijn, daar ze zelden voorkomen en alleen in late gevallen van borreliose. Juist in chronische patiënten zijn het zeer specifieke antilichamen tegen B. burgdorferi. Hilton et al. zijn dan ook van mening dat door het weglaten van deze twee banden een duidelijke onderrapportage, in hun studie van 8%, plaats vindt. Juist deze twee banden blijken meer specifiek te zijn dan sommige van de andere voorgestelde antilichamen en zij pleitten dan ook voor het opnemen van het OspA en OspB in de criteria.
Het is bekend dat OspA aanwezig is tijdens de infectie door de teek, echter een "downregulatie" van OspA en een "upregulatie" van het OspC vindt plaats na de besmetting. Schutzer et al. kon bij patiënten met een EM een vroege antilichamen OspA respons aantonen, echter geen vrije antilichamen, maar wel immuuncomplexen van het OspA. In een experiment met muizen kon Schutzer zijn theorie bevestigen en toonde antilichamen tegen OspA in immuuncomplexen tijdens het begin van de infectie aan. Bovendien schijnt het OspA van B. garinii een belangrijke rol te spelen in de pathogenese van LB in Europa. Eveneens is het verwonderlijk dat het antilichaam p34 (OspB) (als het zo onbelangrijk is) juist gekozen werd voor de bereiding van een vaccin, wat later van de markt werd genomen vanwege het ontstaan van artritis in gevaccineerde patiënten.
Ten vierde gaat de CDC er van uit dat de immuunrespons in iedere Lyme-borreliose patiënt hetzelfde is.

Voor zover nu bekend zijn er drie humaan pathogene genospecies van Borrelia burgdorferi s.l. in Europa tw. B. burgdorferi s.s., B. garinii en B. afzelii en deze zijn nog verder onder te verdelen in verschillende serotypen gebaseerd op de verscheidenheid van de Osps. Zo zijn er acht verschillende OspA's en meer dan 20 verschillende OspC's. Zo is volgens Marconi et al. voor het B. garinii OspA serotype 4 stam een duidelijke correlatie met neuroborreliose in Europa. Hoewel dit serotype voornamelijk geïsoleerd is uit CSF van neuroborreliose patiënten, was het tot op heden niet mogelijk deze stam direct uit de teek te cultiveren. De B.g. OspA 4 stam schijnt een sterk potentiaal te hebben voor disseminatie en een groot tropisme (groeirespons) voor het centrale zenuwstelsel in vergelijk met andere OspA serotypen. Gezien de associatie tussen dit serotype B.g. OspA 4 en neuroborreliose en het binnendringen in het centrale zenuwstelsel is het mogelijk dat dit serotype een hogere pathogeniteit heeft dan de andere OspA serotypen. Deze heterogeniteit van de Osp serotypen zorgt voor de nodige complicaties bij het standaardiseren van de methode.

Volgens Hauser et al. kunnen de criteria van de CDC die opgesteld zijn voor surveillance doeleinden in de U.S. niet in Europa toegepast worden omdat daar alleen B. burgdorferi s.s voorkomt. De criteria moeten refereren aan de borrelia stam waarvoor zij ontwikkeld zijn. Criteria gebaseerd op tenminste twee reactieve banden van een voorgestelde combinatie zijn meer betrouwbaar dan een voorschrift dat slechts 1 band vereist. Echter een 2 banden eis kan leiden tot duidelijk verlies aan sensitiviteit.

In Europa is er geografisch een grote verscheidenheid voor wat betreft het voorkomen van de verschillende genospecies, met volgens Reed een significante antigenenvariatie binnen elk genospecies. Hetgeen tot onvoorspelbare reactiviteit kan leiden met de te onderzoeken patiëntensera.

In een studie van Robertson et al. dat werd uitgevoerd als onderdeel van EUCALB, heeft men geprobeerd om tot een standaardisatie van de Western Blot voor Europa te komen. Een standaardisatie van een immunoblot methode voor de diagnose van LB vereist een overeenstemming voor het gebruik van de stam, voor de preparatie van de antigenen en het protocol. Het is onwaarschijnlijk dat deze benadering bruikbaar is in Europa, omdat LB niet hetzelfde is in alle gebieden in Europa vanwege de stamverschillen. De conclusie is dat men bij de WB de stam moet gebruiken die prevalent is in het endemische gebied. Volgens Norman et al. werden met zo'n test waarbij een locale stam werd gebruikt een hoger aantal positieven gevonden dan met een test met de B31 stam. Door het gebruik van een locale B. afzelii stam kon Jovicic et al. eveneens de sensitiviteit van de test verhogen.

Uit de studie van Ornstein et al. blijkt b.v. dat in het zuiden van Zweden overwegend B. garinii en B. afzelii voorkomen, terwijl B. burgdorferi s.s. slechts tweemaal geïsoleerd werd bij LB. Zij vond dat de verscheidenheid van B. garinii OspA serotypen afhankelijk was van de geografische verspeiding. Een vergelijking van de B. garinii OspA serotypen van Zweden met die van Japan toonde een verschil van OspA op de twee continenten aan. Gezien de variaties in immunodominante proteïnen in de borrelia stammen wordt een locale stam aanbevolen. Deze dient samen met de informatie m.b.t. de seroreactiviteit in de populatie die getest moet worden, gebruikt te worden voor de ontwikkeling van diagnostische serologische testen. Het is dan ook denkbaar dat commerciële kits ontworpen worden met de specifieke stam voor een bepaalde geografisch gebied. De studie van Robertson et al. laat dan ook en grote verscheidenheid zien t.a.v. het gebruik van de B. burgdorferi stammen en de interpretatie van de gegevens van de WB test in de verschillende Europese laboratoria.

In een studie van Nohlmans et al. werden de verschillende genospecies onderzocht van B. burgdorferi s.l. die in Nederland voorkomen. Het werd duidelijk dat er een grote variabiliteit bestaat betreffende de antigenen bij de verschillende genospecies. Zo reageerde alle 10 B. burgdorferi s.s. species met de Mab (monoclonale antibodies) H9724(flagellum) , H5332(OspA), H3TS(OspA), H6831(OspB) en was de Mol.massa voor het OspA 31kD. Echter bij de 9 B. garinii species, was slechts alleen met het H9724 een reactie en met de andere Mab's niet, terwijl de Mol.massa voor het OspA in 8 species bij 33 kD en bij één bij 34 kD lag. 

Uit het bovenstaande wordt al meteen duidelijk welke beperkingen de commerciële WB heeft. Ideaal zou zijn om de hele cellysaten van alle drie de genospecies te gebruiken echter is de test dan niet meer af te lezen. Daarom wordt meestal één genospecies gebruikt of een mengsel van recombinant antigenen. Volgens Hauser et al. is er een duidelijk verschil te zien in WB uitslagen bij gebruik van verschillende stammen. Het is dan ook noodzakelijk om de significante proteïnen in de WB te identificeren met monoklonale antilichamen om vergelijk mogelijk te maken tussen laboratoria. Helaas zijn niet alle antilichamen als monoklonale AL verkrijgbaar. Het zou wenselijk zijn om bij de WB te kiezen voor één stam, dit is echter tot op heden niet mogelijk. De EUCALB stelt dan ook, dat commerciële ondernemingen zich moeten realiseren dat immunoblot interpretaties niet toepasbaar zijn in LB in verschillende geografische gebieden. Deze aanwijzing geldt natuurlijk eveneens voor iedereen die met WB te maken heeft inclusief laboranten en medici.

Net zoals bij de ELISA moet men bij de WB voor een aantal parameters kiezen. Men wil een zo hoog mogelijke specificiteit van tenminste 98% wat ten koste gaat van de sensitiviteit. Volgens de WAO/CDC richtlijn 1995/S141 moet de specificiteit van een conformatietest 98% zijn.

Goossens et al. stelde vast dat de specificiteit van de door hem onderzochte commerciële WB kits voor IgG lag bij 94 tot 100% maar dat de sensitiviteit slechts 46% was, dus 54% fout negatief. Het is duidelijk dat met een dergelijke sensitiviteit men niet kan spreken van een "conformatietest" en de EUCALB noemt de ELISA dan ook de "eerste test" en de WB een "toegevoegde" test die de diagnose ondersteunt i.p.v. bevestigt.

Schulte-Spechtel et al. toonde in een recente studie aan dat zowel de sensitiviteit als de specificiteit van de immunoblot significant verhoogd kon worden naar 86,1% voor beide door het gebruik van extra recombinanten, t.w. VlsE en DbpA van B.garinii. Dit in vergelijking met de hele cellysaten immunoblot waarvoor een sensitiviteit van 52,7% en een specificiteit van 63,8% werd vastgesteld. De studie werd met 36 neuroborreliose patiënten doorgevoerd en het is een bekend gegeven dat B. garinii hoofdzakelijk bij deze patiënten wordt aangetroffen.

Volgens Tylewska et al. is het verkrijgen van voldoende gevoeligheid voor de antilichamentest niet alleen afhankelijk van de locale omstandigheden, maar ook van de keuze van de B. burgdorferi genospecies die gebruikt worden voor de bereiding van de diagnostische antigenen voor zowel de ELISA als de blotstrips. Zij concludeert dat er geen correlatie is tussen de gevonden antilichamentiters in de ELISA en het aantal banden dat aanwezig is in de Western blot. In 30% van de patiënten werden antilichamencomplexen gevonden tegen B. burgdorferi en dat is in overeenstemming met andere onderzoekers die 46 tot 95% vonden. Lage of zelfs niet detecteerbare antilichamentiters in Lyme-borreliose kunnen veroorzaakt worden door circulerende immuuncomplexen, welke gevormd worden speciaal in aanwezigheid van een overmaat aan antigenen, die een teken zijn van een actieve ziekte. Bovendien, Lymepatiënten die levende spirocheten in lichaamsvloeistoffen hebben, laten lage of negatieve titers van antilichamen zien in het serum, aldus Tylewska.

Voor Europa zijn geen criteria voor de Western blot van kracht vanwege de grote verscheidenheid van de gebruikte testen en het probleem van de heterogeniteit van de borrelia genospecies in verschillende geografische gebieden. De EUCALB verwijst naar de aanbeveling MIQ12: Lyme Borreliosis, Quality Standards for the Microbiological Diagnosis of Infectious Diseases van de German Society for Hygiene and Microbiology.

De MIQ criteria voor een positieve western blot zijn de volgende:

De bovenstaande criteria voor de hele cellysaten methode gelden alleen bij gebruik van de PKo B. afzelii stam, die het OspC en p17 immunodominant uitdrukken, daar waar andere stammen deze in vitro niet laten zien. Volgens Wilske et al. kunnen de twee-band criteria hier gebruikt worden zonder al te veel verlies van sensitiviteit in tegenstelling tot het gebruik van de B. burgdorferi s.s. stammen en de B. garinii PBi stam.

Volgens de criteria van de MIQ12 worden de banden p41, p31(OspA) en p34 (OspB) ook hier niet meegeteld wat volgens Hilton et al. tot een onderdiagnose leidt. Het p41 kan kruisreacties geven, maar het p31 en p34 zijn specifieke antilichamen die vooral in late Lyme voorkomen. Sommige LLMD's (Lyme literate Medical Doctors) beoordelen een Western blot positief als er slechts één specifieke band aanwezig is.

Nemen we bijvoorbeeld de volgende hele cellysaten WB-uitslag van een LB patiënt met IgG; p41, p34, p30, p20 dan is deze volgens de MIQ negatief, hoewel een lymespecialist deze uitslag samen met een hoge PPV waarschijnlijk als positief zal beschouwen. Na 3 maanden werd het serum van deze LB patiënt nogmaals onderzocht met het volgende resultaat, IgG; p83, p41, p39, p34, p20. Door de twee andere banden die nu zichtbaar waren werd het resultaat positief. Ook het gegeven van een antigenenvariatie wijst op een actieve infectie. Hieruit blijkt dat de nodige voorzichtigheid is geboden bij toepassing van deze criteria die nogal willekeurig gekozen zijn en geen rekening houden met specifieke banden voor de verschillende stadia. In bovengenoemd geval werd de patiënt drie maanden medicatie onthouden. Zo komt volgens MIQ in late Lyme meestal alleen het IgG voor, de aanwezigheid van alleen IgM in late Lyme correleert niet met de klinische activiteit van de infectie. Zo ook is OspA een marker voor chronische arthritis in Lyme. Andere wetenschappers beweren dat een IgMrespons in chronische LB een teken is van recurrens.

Een lijst met alle relevante antilichamen is te vinden op deze en de volgende link.

Volgens de MIQ12 moet een immunoblot, als deze gebruikt wordt als bevestigingstest, voldoen aan de hoogste kwaliteitseisen met betrekking tot productie, implementatie en interpretatie. In de praktijk zijn de routinecondities vaak niet in overeenstemming met de gestelde eisen. De belangrijkste reden van deze tekortkoming is dat LB geen seksuele overdraagbare ziekte is en daarom geen officiële toelating nodig is voor de commerciële kits. Dit betekent dat er nauwelijks collaboratieve studies bestaan die de sensitiviteit, de specificiteit en de reproduceerbaarheid van de testen bepaald hebben, om vast te stellen of ze voldoen aan de gestelde criteria bij gebruikt in de markt. Medici dienen daarom behoedzaam de geleverde resultaten van het laboratorium te controleren of ze plausibel zijn in dit opzicht. Het is aan te bevelen, dat twijfelachtige resultaten geverifieerd worden door een gespecialiseerd laboratorium. Altijd dienen bij een Western blot alle gevonden banden te worden opgegeven in het medisch rapport. Gezien de tekortkomingen van zowel de ELISA en de Western Blot is het aan te bevelen als de twee-test doorgevoerd wordt om beide testen tegelijkertijd te laten doorvoeren dit verhoogt de sensitiviteit. Donta vond 52% van de patiënten die een positieve WB hadden seronegatief met de ELISA. Aguero-Rosenfeld et al. liet zien dat 30% van de LB patiënten geen immuunrespons hadden. In een "position paper" stelt de ILADS dat 40% van de LB patiënten serologisch worden gemist. Zijn de test uitslagen van de testen negatief en bestaat er toch een sterke klinische aanwijzing voor de ziekte, dan is een herhaling van de test na 6 weken tot 3 maanden te overwegen, daar het hier geen statisch systeem betreft.

Er zijn vele studies die de seronegativiteit bij een LB hebben aangetoond (zie pathogenese en compilatie). Ook zijn er talloze studies die de oorzaken beschrijven m.b.t. fout-negatieve immunologische testen (compilatie).