Print

De ziekte van Lyme is een klinische diagnose en de ELISA dient ter ondersteuning van de diagnose en niet als vervanging.(FDA CBO aanbeveling). Een negatieve ELISA sluit namelijk de ziekte niet uit zoals uit het volgende zal blijken.

Het gebruik van de ELISA is niet op de eerste plaats vanwege de gevoeligheid, maar meer om het gemak en de kostenoverweging.

Bij de ELISA kunnen zich volgende problemen voordoen die betrekking hebben op de sensitiviteit en de specificiteit. De sensitiviteit is het percentage van juist geteste Lymepatiënten en de specificiteit is het percentage van juiste geteste gezonde personen. Een specificiteit van 95% betekent dat van 100 gezonde personen bij 5 een positieve test het gevolg was dus 5% fout positief. Een sensitiviteit van 60% betekent dat van 5 Lymepatiënten er 3 een positief resultaat hadden en dat 2 van de 5 Lymepatiënten een negatieve test hadden. Neemt men in dit laatste geval de testuitslag als basis voor de diagnose dan krijgen 2 van de 5 patiënten een verkeerde diagnose.

Aangezien elke positieve of twijfelachtige ELISA bevestigd moet met de Western blot probeert men de ELISA een zo hoog mogelijke specificiteit te geven. Blijkt namelijk achteraf dat de Western blot negatief is dan was deze test eigenlijk onnodig als de specificiteit van de ELISA hoger was geweest. Daar een Western blot ongeveer tweekeer zo duur is als een ELISA zal men de specificiteit van de ELISA dus zo hoog mogelijk maken om de kosten van een overbodige test te besparen. Echter een hoge specificiteit gaat ten koste van de sensitiviteit en deze wordt dan ook daardoor lager.

In Europa komen tenminste 3 verschillende humaanpathogene Borrelia genospecies voor te weten B. burgdorferi, B. garinii en B. afzelii. Deze 3 genospecies hebben een verschillende antigenen expressie en zelfs in één genospecies is er verschil in antigenen. Zo zijn er 7 verschillende OspA serotypen en meer dan 20 verschillend OspC’s. Hierbij laat B. garinii, het in België (53% van de geïnfecteerde teken) meest voorkomende serotype, de grootste heterogeniteit zien. Voor Nederland zijn geen cijfers beschikbaar.

Klik op de afbeelding om te vergroten

Eigenlijk zou men het serum van de patiënt moeten testen met alle serotypen daar men immers niet weet met welke stam de patiënt geïnfecteerd is. In de routine wordt de meest voorkomende stam genomen in de test. De EUCALB adviseert dat een test geschikt dient te zijn voor de stammen die in het endemische gebied voorkomen. Norman et al. stelde vast dat door het gebruik van de B. garinii stam in een onderzoek in België iin plaats van B. burgdorferi s.s. B31 een groter aantal positieven gevonden werd. Ook Ornstein et al. adviseert het gebruik van een locale stam vanwege de expressie van verschillende gehaltes aan immunodominante antigenen in verschillende serotypen. Het is echter bekend dat er niet alleen grote verschillen zijn tussen Noord-Amerika en Europa maar dat er ook grote verschillen zijn binnen Europa m.b.t. het voorkomen van de verschillende stammen.

Voor het uitvoeren van de ELISA is het mogelijk om gesoniceerde Borrelia bacteriecellen als hele cellysaten te gebruiken voor de uitgangssuspensie. Het voordeel zoals later zal blijken is dat een groot aantal verschillende antigenen aanwezig zijn waardoor de sensitiviteit hoog is, maar de specificiteit is nogal laag waardoor veel foutpositieven opnieuw bevestigd moeten worden. Een ander nadeel kan zijn dat de stammen in vitro andere antigenen produceren dan in vivo. Het werken met hele cellysaten geeft dus een hoge sensitiviteit maar vereist grote vakkennis. Alleen gespecialiseerde laboratoria zijn daarom aanbevolen.

In de meeste gevallen zal gebruikt worden gemaakt van commerciële testkits. Deze zijn of samengesteld uit gereinigde hele cellysaten of recombinanten antigenen of een combinatie van beide. De recombinanten antigenen worden gewonnen door het betreffende gen te plaatsen in een E. coli bacterie en deze produceert op deze manier het antigeen. Het voordeel is dat men een juiste standaard van zuiverheid kan maken en dat men een mengsel van recombinanten kan maken waaruit de antigenen die voor kruisreacties zorgen zijn weggelaten. Echter niet alle antigenen zijn als recombinant te maken, daardoor is de kans aanwezig dat eventuele antilichamen niet gebonden worden omdat het corresponderende antigeen niet aanwezig is. Hierdoor zou de test dus fout negatief kunnen zijn.

Een reëel probleem van de antilichamen test is dat alleen vrije antilichamen aangetoond kunnen worden. Een groot misverstand is dat lage titers een beperkte infectie weerspiegelen wat niet juist is. Lage of negatieve antilichamen titers duiden bij een infectie erop dat de antilichamen “geconsumeerd” zijn en dat levende bacteriën de overhand hebben of dat het immuunsysteem geen of onvoldoende antilichamen aanmaakt. Tylewska et al. kon geen antilichamen aantonen in patiënten met levende borrelien in het serum.

Een belangrijke studie in deze samenhang is die van Schutzer et al. die aantoont dat direct bij het begin van de infectie wel immuuncomplexen aanwezig zijn, maar geen vrije antilichamen. De algemene verbreide mening dat het immuunsysteem vertraagd reageert bij een infectie met Borrelia, moet volgens deze studie dan ook herzien worden. De antilichamen worden wel geproduceerd, maar we kunnen ze niet aantonen met de gebrekkige ELISA. Nog verbazingwekkender is het feit, dat Schutzer een eenvoudige dissociatie procedure aangeeft, waardoor immuuncomplexen kunnen worden aangetoond en dat deze procedure niet tot de standaardprocedure behoort.

Hardin et al. beschreef reeds in 1979 circulerende immuuncomplexen in LB die hoofdzakelijk voorkwamen in patiënten met een actieve infectie. Een onderzoek op deze manier kan namelijk niet alleen in een vroeg stadium, waarbij alleen complexen aanwezig zijn, antilichamen aantonen, maar tevens kan een onderscheid gemaakt worden tussen een serologisch litteken en een actieve infectie. Brunner et al. komt tot vergelijkbare resultaten door gebruik te maken van PEG (polyethyleen glycol) neerslagen die immuuncomplexen bevatten. Op deze wijze konden antilichamen aangetoond worden, die niet als vrije antilichamen aanwezig waren, hetgeen normaal een negatieve ELISA zou hebben geven. Deze detectiemethode is dan ook van uitermate belang voor de differentiatie van een actieve en een voorbije LB, maar zou eveneens kunnen dienen als opvolging voor een succesvolle therapie en een eindpuntbepaling.

De borrelia is een unieke bacterie, de meest gecompliceerde die we op het moment kennen. De veranderlijkheid van deze bacterie is geen toeval maar genetisch ingebouwd. Zodra het immuunsysteem passende antilichamen heeft gemaakt tegen de antigenen, dan vindt een verandering van de antigenenexpressie plaats om te kunnen overleven. Dit fenomeen van antigenenvariatie kennen we ook van sommige anderen bacteriën en dit mechanisme is waarschijnlijk verantwoordelijk voor het recurrerende karakter van de ziekte.

De antigenvariatie speelt natuurlijk ook een probleem voor het maken van de uitgangssuspensie voor de test. Er moeten immers wel corresponderende antigenen aanwezig zijn om met de antilichamen een binding te veroorzaken en om zo een positief resultaat te geven.

Het mag duidelijk zijn dat bovenstaande omstandigheden elk de sensitiviteit van de onderzoekmethode beïnvloeden. De commerciële kits voor het aantonen van antilichamen tegen B. burgdorferi zijn gebaseerd op verschillende uitgangssuspensie waardoor er in geografisch verschillende gebieden verschillende resultaten kunnen worden verkregen. In een studie uitgevoerd door EUCALB met de participatie van 11 Europese referentie laboratoria werd duidelijk, dat er een duidelijke variatie was in de uitkomsten. Het bleek niet mogelijk om gelijke criteria voor het onderzoek op te stellen, ten eerste vanwege de grote verscheidenheid van de gebruikte onderzoeksmethoden en ten tweede door de regionale verschillen met betrekking tot het voorkomen van de verschillende genospecies, waaraan volgens de aanbeveling de methode dient te zijn aangepast.

Reeds in andere studies werd duidelijk dat de ELISA test als screening test meestal niet voldoet aan de eisen van de EUCALB die een specificiteit van 95% verlangt. Een minimum standaard voor de sensitiviteit van een test wordt helaas niet gegeven, hetgeen betekent dat ook inferieure testkits op de markt komen. Een studie van Bakken et al. in 1991 kwam tot de onrustbarende conclusie dat slechts 45% van de 500 laboratoria die deelnamen in de studie tot een juist resultaat kwamen. Een herhaling van de studie van Bakken et al. 1996 onder 516 laboratoria toonde aan dat de specificiteit verder was gedaald van 95% naar 81% en dat de sensitiviteit fluctueerde tussen de 93 en 75%.

In een onderzoek van Goossens et al. van de Universiteit van Maastricht werden vijftien verschillende commerciële kits voor het aantonen van antilichamen tegen Borrelia met elkaar vergeleken. De test werd gebruikt voor de verschillende Lymestadia met een sensitiviteit voor IgM in vroege Lyme van 31 tot 81% en in late Lyme van 46 tot 69%. De specificiteit in de controlegroep was 89 tot 75%.

In late Lyme varieert bij deze kits de sensitiviteit voor IgG van 92 tot 54% en in vroege Lyme van 69 tot 31% terwijl de specificiteit voor niet-Lymepatiëntengroep varieert van 84 tot 98%.  Aan het criterium van 95% van specificiteit in de niet-Lymepatiëntengroep voldeden 3 van de 8 kits, echter de sensitiviteit voor deze drie varieerde van 46 tot 77% in late Lyme. Volgens deze studie is er dus ongeveer gemiddeld een IgG sensitiviteit voor de commerciële ELISA kits van 60%, dus 40% fout-negatief, dat zijn 2 van de 5 Lymepatiënten.

Ook andere wetenschappers komen met vergelijkbare sensitiviteitscijfers, Luger et al. vond een fout-negatief gehalte van 56% en Golightly et al. rapporteerde meer dan 70% fout-negatief met commerciële kits in vroege Lyme en tussen de 4 en 46% met late Lyme. Een negatieve ELISA betekent dat in het serum op het moment van de bloedafname geen vrije antilichamen konden worden vast gesteld boven een bepaalde titer met de antigenen die in de ELISA-test werden gebruikt.

Het mag duidelijk zijn dat een negatieve ELISA een infectie met B. burgdorferi niet uitsluit.